杨利国

牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法研究

日期:2011-10-11 10:22 来源:华中农业大学学报作者:杨利国点击量:

牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法研究

   随着胚胎移植技术在养牛业中的逐步推广,牛早期胚胎的性别鉴定则成为控制其后代性别的有效方法。在胚胎性别鉴定方法的研究中, H2Y 抗原法[1 ] 、荧光原位杂交法( FISH) [2 ,3 ] 等由于其时间长、费用高等因素,很难得到广泛的推广应用。多聚酶链式反应( PCR) 因其快速、灵敏、准确等优点,故在牛的胚胎性别鉴定中得到了普遍应用[413 ]

在目前常用的牛胚胎性别鉴定PCR 法有常规PCR [510 ] 和巢式PCR [11 ] ,由于巢式PCR 2 次扩增效应,使用微量的模板即能获得大量PCR产物,大大增加了扩增的效应及灵敏度。因此,在本试验中,笔者根据牛S R Y 基因序列自行设计了2 对嵌套式引物作为公牛特异性引物,同时根据牛β珠蛋白基因( HB B) 序列设计了1 对引物作为内参照引物,建立了巢式PCR 反应体系,并以微量的卵母细胞和精子细胞为模板对该反应体系的灵敏性进行了检验,以期建立牛早期胚胎性别鉴定的方法。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

随机从武汉开隆牛场选择50 头母牛,前腔静脉采血5 mL ,EDTA 抗凝, - 20 ℃保存备用。公牛精液共30 ,取自湖北省畜牧局种公牛站, - 20 ℃保存备用。

从武汉某屠宰场刚屠宰的母牛体内取出卵巢,保存在装有37 ℃无菌生理盐水的保温瓶中带回实验室,在倒置显微镜下从卵泡腔内吸出单个卵母细胞。精子细胞取自由湖北省畜牧局种公牛站所得到的新鲜精液。

1. 2 主要仪器和试剂

PCR (德国Biomet ra 公司) BIO2RAD 凝胶成像系统、核酸蛋白浓度测定仪(德国Biochrom 公司) 、倒置显微镜(日本尼康2000E ) Taq DNA聚合酶(北京天为时代有限公司) dN TP (武汉凌飞有限公司) 、蛋白酶K(上海生工生物工程技术有限公司)

1. 3 样本DNA 的提取

1) 牛血液DNA 的提取。参照文献[ 14 ] ,将所提取的DNA TE 溶解后,经核酸蛋白浓度测定仪测定浓度,并稀释到100 ng/μL , - 20 ℃保存备用。

2) 牛精子DNA 的提取。取200 μL 新鲜精液于1. 5 mL 离心管中,8 000 r/ min 离心5 min ,去除上清液。向精子沉淀中加入320 μL 双蒸水,80 μL精子提取液[ Tris2HCl 50 mmol/ L (p H 8. 0) , ED2TA2Na 50 mmol/ L (p H 8. 0) ,NaCl 500 mmol/ L ,DTT 38. 9 mmol/ L , 10 % SDS ( m/ V ) 16 μL ] ,100μL 蛋白酶K ( 10 mg/ mL ) , 37 ℃消化过夜。DNA 提取方法参照文献[ 14 ] 。同样将提取的DNATE 溶解后,经核酸蛋白浓度测定仪测定浓度,稀释到100 ng/μL , - 20 ℃保存备用。

3) 牛微量细胞DNA 的提取。煮沸法:将卵母细胞或精子细胞用无菌超纯水冲洗3 次后,放入0. 5 mL PCR 管中,加入10μL 无菌超纯水,100 ℃煮沸1015 min ,立即置于冰上冷却,离心后取上清液进行PCR 检测。

1. 4 引物的设计

根据Genbank 上所给出的牛S R Y 序列设计了2 对巢式PCR 引物(SRY1 SRY2) 作为性别鉴定中的公牛特异引物,同时根据牛β珠蛋白基因序列设计了1 对引物作为内参照引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。各引物信息如表1 所示:


 

(责任编辑:中国奶牛产业网)
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